Биотехнологические особенности получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам

Введение

Население нашей планеты на 1 января 2018 года составляет 7,3 миллиардов человек и стремительно продолжает расти. В наше время есть люди и более того этих людей очень много, их миллионы, которым не хватает воды и пищи. Это связано с проблемой влияния человечества на окружающую среду. Сюда относится загрязнения, выбросы отходов в окружающую среду, использование природных ресурсов, снижение плодородия почвы, её истощение и поэтому все важнее и важнее становится вопрос производства продуктов питания.
Мальтус (1766 – 1834) впервые высказал мысль о том, что при росте народонаселения будет увеличиваться дефицит сельскохозяйственных земель для производства продовольствия и сырья для товаров потребления. Это высказывание подтверждается в полной мере даже спустя 200 лет.
В ХХ веке потеряно по разным оценкам около 20 % плодородных земель от общего их количества. Площадь земной поверхности, которая необходима для обеспечения жизни одного человека в конце ХХ века составляла 17500 м2. В настоящее время из-за деградации их площадь заметно сокращается – происходит биологическая деградация, опустынивание, смыв плодородного слоя, изъятие под хозяйственные нужды. С переходом на выращивание технических культур для производства метанола произойдет уменьшение посевных площадей на треть, где не будут выращиваться продовольственные культуры, что ещё больше усугубит положение с питанием населения.
Так же проводились широкие эпидемиологические исследования и мониторинг организованный Минздравом России, которые показали, что структура питания населения характеризуется снижением потребления наиболее ценных в биологическом отношении пищевых продуктов. Вследствие сложившейся структуры питания происходят нарушения пищевого статуса (дефицит белков, нехватка витаминов, макро- и микроэлементов). В международном научном сообществе существует понимание того, что в связи с ростом население Земли, которое к 2050 году должно достичь 9-11 млрд человек, необходимо удвоение и даже утроение мирового производства сельскохозяйственной продукции, что не возможно без применения трансгенных растений, создание которых многократно ускоряет процесс селекции культурных растений, увеличивает урожайность, удешевляет продукты питания, а также позволяет получить растения с такими свойствами, которые не могут быть получены традиционными методами.
В современном сельском хозяйстве широко применяются гербициды – это химические вещества, которые используют для борьбы с сорной растительностью. Они подавляют метаболизм растительных клеток: ингибируют биохимические процессы, прежде всего, фотосинтеза (диурон, атразин, симазин) и синтез аминокислот (биалафос, глифосат, сульфонилмочевина). По характеру действия они делятся на гербициды сплошного действия, которые губительно воздействуют на все виды растений, и селективного (избирательного) действия, которые поражают определенный вид растения. Основной проблемой использования гербицидов является то, что не существуют идеальных гербицидов, которые бы уничтожили только сорняк, при этом, не воздействуя пагубно на сельскохозяйственную культуру. Даже гербициды селективного действия могут вызвать поражения культурных растений. Одним из перспективных направлений генной инженерии в сельском хозяйстве являетсяВведение

в геном растений аллелей, которые контролируют устойчивость к гербицидам. Существует два подхода получения устойчивых к гербицидам растений: - прямая селекция устойчивых к гербицидам форм растений, например путём скрещивания сельскохозяйственной культуры с дикими видами растений, которые устойчивы к гербицидам; - получение трансгенных растений путём введения генов, экспрессия которых приводит к гербицид-резистентности. Устойчивость к гербициду возникает в результате изменения сродства гербицида с его ферментом-мишенью или ингибирования молекулы гербицида. Основой для создания трансгенных растений служит изучение механизмов устойчивости. Оно состоит из четырех этапов: - выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений; - отбор растений, устойчивых к данному гербициду в качестве источника генов резистентности; - идентификация и клонирование этих генов; - изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. Благодаря использованию методов генетической инженерии, были созданы сельскохозяйственные культуры, которые устойчивы к различным гербицидам.
Целью работы является изучение вопроса биотехнологии получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам.
Для достижения цели работы необходимо осветить ряд задач:
1. История развития получения трансгенных растений
2. Обзор основных моментов биотехнологического процесса получения растений


1. История развития генной инженерии и возможности использования трансгенных растений
Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.
После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", а также гербицид-устойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.
В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные растения были высажены на общей площади порядка 40 млн. га, что превышает размеры такой страны, как Великобритания. В США генетически модифицированные растения (GM Crops) составляют сейчас около 50% посевов кукурузы и сои и более 30-40% посевов хлопчатника. Это говорит о том, что генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки. В ближайшие годы ожидается дальнейшее быстрое увеличение площадей, занятых трансгенными формами культурных растений.
Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).
Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.
Успехи в области генетической инженерии растений открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансляционная модификация и правильная укладка (фолдинг) полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков.
По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. В дополнение ко всему перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными.
Известно, что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может быть адаптирован не только для накопления гомологичных белков, не синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков как бактериального, так и животного происхождения. С другой стороны, сами растения in vivo могут служить благоприятной средой для развития различных организмов - бактерий и вирусов, геном которых может быть модифицирован и адаптирован для синтеза соответствующих гетерологичных белков. Анализируя данные литературы, необходимо отметить, что поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов за последние десять лет был связан с развитием трёх основных подходов.
Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перенесены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков. Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было использовать и гены гетерологичных белков медицинского назначения. Необходимо отметить, что использование только агробактериального переноса в значительной степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его, как правило, до двудольных. Поэтому дальнейшее развитие идеи использования растительного генома для синтеза гетерологичных белков стимулировало поиск новых способов переноса фрагментов экзогенной ДНК в геном растений. Были разработаны методы прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции, электропорация и методы биобаллистики. В этом случае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструкции с целевыми генами.
При переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются потомкам в последующих поколениях согласно законам Менделя.
Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них необходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях табака составило 0,02 % от суммарного белка. Ещё меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003 %) и b-интерферона (0,001 %). Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродного гена, когда её уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов. Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме растительной клетки.Введение

в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляю-щих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз. Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, содержание химерного энкефалина человека в семенах трансгенного A. thaliana составило 2,9 % от суммарного белка. Этого удалось достичь введением в полипептидную цепь энкефалина сигнальной последовательности глютелина (запасного белка риса), направляющей его транспортировку в компартменты накопления запасных белков. Химерный ген находился под контролем промотора гена глютелина, который направлял его тканеспецифичную транскрипцию в клетках запасной ткани семян.
Интеграция чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При получении трансгенных растений в сельскохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду (выход из-под контроля) в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для повышения уровня биобезопасности рядом исследователей было предложено использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения.
Другой проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном растений, является вероятность "замолкания" трансгенов в последующих поколениях (сайленсинг). Вероятность сайлен-синга резко возрастает при встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения. Поэтому при создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного гена.
В связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в ядерный геном, весьма привлекательным представляется способ переноса экзогенной ДНК в геном хлоропластов. Хлоропласты - органеллы растительной клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, а также ряд других пигментов, принимающих участие в поглощении световой энергии и осуществлении фотохимических реакций. По форме и размерам хлоропласты высших растений достаточно однородны. Некоторая вариабельность наблюдается в отношении их числа в расчете на одну клетку, которое варьирует от нескольких десятков до сотни и более. Каждый отдельный хлоропласт окружен двойной мембраной и имеет сложную внутреннюю структуру. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до 10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от суммарного белка клетки. Однако в литературе встречаются только единичные работы по получению растений с генетически модифицированными хлоропластами. Это связано с чрезвычайной сложностью методов их трансформации и последующего отбора.
Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные ткани. На этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного генома и адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения соответствующих генетических конструкций, но и в качестве матриц для транзиентной экспрессии генов, кодирующих синтез белков, представляющих коммерческий интерес. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений.
В настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных белков в растениях: вирус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора репликации ВИЧ α-трихосантина в Nicotiana benthamiana. Для этого целевую последовательность, кодирующую α -трихосантин, поместили под субгеномный промотор белка оболочки ВТМ. Спустя две недели после заражения рекомбинантный α -трихосантин накапливался в листьях N. Benthamianaв количестве 2 % от суммарного белка. На основе ВМКГ удалось получить химерные частицы этого вируса с экспонированными на поверхности антигенными детерминантами ВИЧ1 (gp41). Для этого последовательность эпитопа gp41 была "сшита" с геном белка оболочки ВМКГ. Такие частицы обладали высокой иммунногенностью и были способны нейтрализовать инфекционные свойства ВИЧ1 in vivo.
Сравнивая пути наработки гетерологичных белков в растительных тканях, необходимо отметить, что каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В трансгенных растениях перенесенные гены стабильно встраиваются в геном и сохраняются в последующих поколениях, тогда как при интеграции генов в геном вирусов в зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная) экспрессия. Накопление соответствующих белковых продуктов будет определяться периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны, преимуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий период размножения вирусных частиц, простота инфицирования растений, а также широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы для этих целей.
Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов человека и животных получили название "съедобных вакцин"

. Механизм иммунизации такими вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. В кишечнике чужеродный белок, обладающий антигенными свойствами, распознается специальными М-клетками, которые широко представлены в толще слизистого эпителия. М-клетки транспортируют захваченный антиген к перитонеальным макрофагам и В-лимфоцитам, находящимся в лимфоидных образованиях тонкого кишечника (пейеровых бляшках). В результате презентации антигена на поверхности антиген-представляющих клеток происходит активация T-лимфоцитов-хэлперов, которые в сочетании с антигеном активируют В-лимфоциты. Дифференцированные В-клетки выходят из лимфоидных фолликулов слизистой оболочки и поступают через общую циркуляцию в мезентеральные лимфатические узлы, где происходит их созревание и превращение в плазматические клетки, синтезирующие специфические к антигену антитела. Плазматические клетки способны снова мигрировать к слизистым оболочкам дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трактов. Секреторные иммуноглобулины IgA транспортируются на поверхность слизистых оболочек, где они связываются с чужеродными агентами и препятствуют их проникновению в организм. Следует отметить, что мукозная вакцинация стимулирует как иммунный ответ слизистых оболочек - первого защитного барьера на пути патогенных агентов, так и общий иммунный ответ организма

2. Классификация трансгенных растений
На практике ситуация выглядит следующим образом: среди промышленно выращиваемых трансгенных растений доля устойчивых к гербицидам составляет 71%, устойчивых к вредителям — 22%, устойчивых одновременно к гербицидам и вредителям — 7%, устойчивых к вирусным, 6актериальным  и грибным  болезням — менее 1%.
Среди главных признаков, контролируемых перенесенными генами, на первом месте стоит устойчивость к гербицидам.
Среди генов, определяющих устойчивость к гербицидам, уже клонированы гены устойчивости к таким гербицидам, как глифосат (Раундап), фосфинотрицин (Биалафос), глифосинатаммония (Баста), сульфонилмочевинным и имидозолиноновым препаратам. С использованием этих генов уже получены трансгенные соя, кукуруза, хлопчатник и т.д. В России также проходят испытания трансгенные культуры, устойчивые к гербицидам. В Центре «Биоинженерия» создается сорт картофеля, устойчивый к Басте, проходящий в настояшее время полевые испытания.
Другой распространенной группой являются трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям. Так, относительно давно известна бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирующая белок дельта-эндотоксин, который очень токсичен для многих видов насекомых и безопасен для млекопитающих. Установлено, что встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не повреждаемые насекомыми.
Специалисты по генной инженерии в результате длительной работы подобрали необходимые штаммы Bacillus thuringiensis и создали генно-инженерные конструкции для конкретных групп насекомых.
Так, для получения трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, компании «Моnsanto» понадобилось 16 лет экспериментальной работы и 100 млн. долл. инвестиций.
В настоящее время компаниями «Моnsanto», «АgrEvо», «Мусоgеn» созданы другие трансгенные формы, устойчивые к насекомым, так называемые Bt-растения - соя, хлопчатник, кукуруза.
Специалисты и ученые полагают, что применение Bt –растений будет иметь не только хорошее коммерческое будущее, но и экологический эффект. Известно, что только 5% внесенного инсектицида срабатывает по назначению, остальные 95% попадают в окружающую среду, уничтожая многие виды насекомых, в том числе и полезных. Сокращение же объемов применения инсектицидов приведет к восстановлению популяций многих полезных насекомых, что, несомненно, положительно скажется на многих видах растительного и животного мира.
К третьей группе по распространенности относятся трансгенные растения, одновременно устойчивые к гербицидам и насекомым.
Площади возделывания этих культур увеличились с 0,1% в 1997 г. до 1%   в 1998 г. Примерами этой группы являются кукуруза и хлопчатник, устойчивые к Раундапу и одновременно устойчивые к кукурузному мотыльку и хлопковой совке соответственно.
Менее распространенной является пока группа трансгенных культур, устойчивых к бактериальным, вирусным и грибным болезням.
Одним из первых достижений в защите растений методами генной инженерии явилось создание трансгенных растений, устойчивых к вирусам, путем внесения генов белков вирусной оболочки.
Активный синтез такого белка, обладающего большим сродством с РНК вируса, не дает ей возможности активно размножаться в клетке хозяина, что и обусловливает устойчивость такого трансгенного растения к вирусам. В 1986 г. подобная устойчивость была получена для табака.Введение

гена оболочки вируса табачной мозаики позволило создать устойчивый к нему трансгенный табак. Создаются также трансгенные формы огурцов, арбуза, цукини, устойчивых к различным вирусам и проходящих в настоящее время полевые испытания. К достижениям отечественной науки следует отнести создание картофеля, устойчивого к вирусу Y, который в настоящий момент находится на стадии испытаний.
Активно ведутся исследования по клонированию генов для данных растений от грибных болезней. Так, создан трансгенный табак, несущий ген хитиназы фасоли. Такая культура практически не поражается грибными болезнями даже в почве, зараженной грибным патогеном Rhizoctonia solani. Трансгенные растения табака с геном стилбенсинтазы из винограда обладают повышенной устойчивостью к Воtгynis сinегеа. Получен также трансгенный картофель, несущий ген стилбенсинтазы, устойчивый к фитофторозу и фузариозу.
Компанией «Моnsanto» разработан способ получения трансгенных растений, устойчивых как к бактериальной, так и грибной инфекции. В картофель вводится грибной ген, кодирующий синтез фермента, окисляющего глюкозу с образованием пероксида водорода. Полученные растения устойчивы и к мягкой гнили, вызываемой бактериями рода rwinia, и к фитофторе.
Относительно недавно открыты короткие пептиды, богатые остатками цистеина, обладающие антимикробными свойствами. Они названы дефензинами.
В настоящее время создаются трансгенные растения томатов, картофеля, рапса, моркови, яблони и груши с геном rs дефензинов редьки. Аналогичная работа проводится по созданию трансгенной капусты и малины
Довольно перспективными являются исследования по созданию трансгенных растений, устойчивых к абиотическим факторам. Так расширяются работы по получению трансгенных культур, устойчивых к холоду. Например, при включении в растительный геном регулирующего экспрессию других генов, включающихся при адаптации растения к холоду, получены трансгенные растения, которые выдерживали в течение 2 сут отрицательные температуры, губительные для обычных растений.
Большое внимание уделяется созданию трансгенных растений для пищевой и фармацевтической промышленности. Одним из лидеров этого направления является компания «Са1gеnе». В 1995 г. эта компания получила разрешение в США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным жирнонокислотным составом.
Проводятся также исследования по созданию трансгенных растений с заданным аминокислотным составом. Так, в настоящее время клонированы гены запасных белков сои, гороха, фасоли, кукурузы, картофеля.
Перспективным направлением является создание трансгенных растений, несущих гены, кодирующие синтез вакцин против различных болезней. Так, при потреблении сырых плодов и овощей, несущих такие гены, происходит вакцинация организма. Это значительно расширяет области применения таких трансгенных растений. Например, при введении гена нетоксичной субъединицы энтеротоксина холеры в растения картофеля и скармливании сырых клубней подопытным мышам в их организме образовывались антитела холеры. Очевидно, что такие съедобные вакцины могут стать эффективным простым и недорогим методом защиты людей и обеспечения безопасности питания в целом.
Очень интересным направлением использования трансгенных растений является их применение для фиторемедиации — очистки почв, вод и т.п. от чужеродных загрязнителей внешней среды, в частности тяжелых металлов и радионуклидов. Модифицированную конструкцию бактериального гена, кодирующего белок, который переносит и детоксицирует ртуть, использовали для трансформации табака, рапса, тополя.
Таким образом, направления исследований генной инженерии очень разнообразны и обширны, а некоторые из них фантастичны и в то же время весьма перспективны по достижимости результатов

3. Получение трасгенных растений
Вся работа с трансгенными растениями направлена на коренное изменение методов традиционной селекции – желаемые признаки получаются благодаря введению нужных генов непосредственно в растение вместо длительной работы по скрещиванию различных линий. Сложность такого подхода заключена в том, что в отличие от бактерий и дрожжей, растения, как и животные, являются многоклеточными организмами. Для получения продукта нужный ген должен находиться в каждой клетке организма, что достаточно сложно осуществить. В этом плане растения имеют одно важное преимущество перед животными: возможна их полная регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, способных давать семена, растений. Это свойство, называемое тотипотентностью, дает уникальную возможность получить из единичных клеток, генотип которых можно изменить аналогично микроорганизмам, целое растение с новыми признаками. Задача осталась за поиском подходящего вектора для переноса нужного гена в выделенные камбиальные клетки.
Исследователям помогла сама природа. Еще древним грекам было известно явление, называемое корончатыми галлами. В пораженных растениях клетки корончатых галлов приобретают способность неограниченно размножаться, оставаясь недифференцированными. Такие клетки по своим свойствам очень похожи на раковые клетки животных. Но только в XX веке ученым удалось установить и изучить причину возникновения такого явления. Виновницей оказалась одна из почвенных бактерий – Agrobacterium tumefaciens. Такая бактерия, как и многие другие, содержит плазмиды. Одна из них, названная Ti-плазмида (от английского сокращения «опухоль индуцирующая»), и оказалась опухолеродным агентом для клеток зараженного растения.
Ti-плазмида состоит из нескольких функционально различных участков ДНК. Наиболее важную роль играет участок Т-ДНК, который переносится в клетку зараженного растения и встраивается в ее хромосому. Там находятся гены синтеза фитогормонов и опинов. Фитогормоны ауксин и цитикинин подавляют дифференцировку опухолевых растительных клеток и переводят их в состояние деления, а опины используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Другими участками ДНК в Ti-плазмиде являются tra-область, где локализованы гены, контролирующие коньюгацию бактерий, и ori-область, продукты которой обеспечивают размножение плазмиды в бактериальной клетке. Еще один важный локус ДНК называется vir-область. Там содержатся гены, ответственные за перенос Т-ДНК в растительную клетку и встраивание ее в хромосому.
При заражении какого-нибудь двудольного растения Агробактерией происходят следующие процессы: Агробактерии, в изобилии находящиеся в почве, вступают в контакт со стеблем растения, чаще всего в прикорневой области. Вероятность заражения и опухолевой трансформации значительно возрастает, если у растения имеются ранки или повреждения наружного слоя клеток. Бактерии прорастают в ткани растения, живут и размножаются в межклеточном пространстве, не проникая в клетки. Далее происходит процесс трансформации, который можно разделить на несколько этапов: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия плазмидных генов. Переноса Т-ДНК не происходит, если растение-хозяин оказывается больным или нежизнеспособным. Если же хозяин окажется здоровым организмом, перенос Т-ДНК происходит примерно за 30 минут. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится частью генома растения, и ее гены активно транскрибируются. Клетка приобретает свойства раковой, и происходит рост опухоли – корончатого галла. Бактерии используют трансформированные клетки как фабрику по производству опинов – источника азота, углерода и энергии.
Таким образом, Агробактерии научились генно-инженерным методам задолго до человека. Ti-плазмида оказалась идеальным природным вектором для введения чужеродных генов в клетки растения. Необходимо также отметить следующие достоинства использования методов на основе применения Ti-плазмиды. Во-первых, круг растений – хозяев Агробактерии чрезвычайно широк, включая практически все двудольные растения. В последнее время ученые смогли добиться заражения и многих однодольных, главным образом злаков. Во-вторых, встроенная в геном растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак по законам Менделя, а чужеродные гены имеют собственные регуляторные области. Для промышленного применения Ti-плазмиду необходимо лишь «немного» усовершенствовать. В целом векторная система на основе Ti-плазмиды должна содержать следующие участки:
1) комплекс генов vir-области, необходимой для переноса и интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому растения;
2) систему для узнавания чужеродных генов полимеразами растения – такой промотор есть в Т-ДНК;
3) маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток;
4) уникальные сайты рестрикции, необходимые для введения в конструкцию нужных генов.
Также необходимым условием является отсутствие генов, приводящих к образованию опухоли.
Чаще всего для создания такой генно-инженерной конструкции используют следующий подход. Сегмент Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в стандартную плазмиду-вектор бактерии Escherichia coli. Рекомбинантная плазмида размножается, и в участок Т-ДНК вставляют нужный ген так же, как и в обычную плазмиду, с использованием рестриктаз. Такой молекулярный гибрид вводят в Agrobacterium tumefaciens, содержащий неизмененную Ti-плазмиду. Благодаря процессу рекомбинации происходит обмен гомологичными участками ДНК рекомбинантной и Ti-плазмид. В результате получится рекомбинантная Ti-плазмида, несущая нужный ген. Последним этапом будет заражение единичных растительных клеток такой Агробактерией и выращивание целого растения, все клетки которого будут экспрессировать нужный ген.
Коротко схему можно создания и отбора растений можно представить следующим образом:
Получение изолированного гена. Мы получаем нужный ген либо путем химического синтеза из составляющих ДНК нуклеотидов (что очень долго и дорого, а потому обычно нецелесообразно), либо путем его выделения из клеток других организмов с помощью специальных методик.Введение

гена в вектор для переноса в организм. Вектор — структура, переносящая в клетку соответствующую генетическую информацию, в данном случае тот полезный ген, который был выделен в пункте 1. Обычно в виде векторов используют плазмиды или инактивированные оболочки вирусов. Для трансформации растений иногда также используют липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина.
Перенос вектора с геном в модифицируемый организм с помощью различных манипуляций.В зависимости от используемых клеток и векторов манипуляции могут быть самые разные — от простого капания вектора на необходимые клетки до обстрела клеток вектором из генной пушки.
Выращивание растений из модифицированных клеток.
Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Иногда оказывается проще использовать сразу две рекомбинантные плазмиды. Одна из них содержит только vir-область и является плазмидой-помощницей. Вторая плазмида должна содержать Т-ДНК со встроенным нужным геном. Плазмида-помощница способна переносить в растительную хромосому не только свою Т-ДНК, которой у нее и нет, но и соседнюю. Для облегчения отбора полученных ГМ-растений, рекомбинантная Ti-плазмида несет специальный маркерный ген. В отличие от микроорганизмов, где в качестве маркера используется устойчивость к антибиотикам, в растениях используют особые белки, обладающие способностью светиться в ультрафиолетовом свете. Наиболее часто используют гены люциферазы светлячков и ген GFP медузы (по-английски, «зеленый светящийся белок»).
Помимо технологии, основанной на использовании Ti-плазмиды, в последнее время применяются и другие способы переноса рекомбинантной ДНК в растения. Современный арсенал методов трансформации очень обширен и включает такие подходы, как электропорация клеток (пропускание электрического разряда через смесь опытных клеток и рекомбинантных плазмид, при этом в мембранах клеток возникают бреши, и ДНК проникает в клетку и встраивается в геном), встряхивание смеси клеток, ДНК и микроигл (которые прокалывают мембраны аналогично электрическом току),опосредованная вирусами инфекция, микроинъекции ДНК в клетки. Промышленное применение нашла следующая технология: с помощью специального прибора «Shotgan» осуществляется обстрел растительных тканей мельчайшими пульками из золота или вольфрама, одетыми в молекулы ДНК.
В отдельных случаях оказывается необходимо не ввести какой-нибудь новый ген в растение, а наоборот, заблокировать или ослабить действие природного гена. В качестве примера могут служить плоды томата, которые во время созревания содержат значительное количество специального белка PG, придающего плодам рыхлость. Для устранения этого белка в плоды вводят вектор, содержащий перевернутую копию его гена. В результате транскрипции получается антисмысловая (перевернутая) мРНК, которая комплиментарно связывается с нормальной мРНК