Задать вопрос
Зарегистрируйся в два клика и получи неограниченный доступ к материалам,а также
промокод
на новый заказ в Автор24. Это бесплатно.
ВВЕДЕНИЕ
В нашу «постгеномную» эру непросто найти того, кто не слышал о проекте «Геном человека». Если описать его коротко: 13 лет (1990–2003), три миллиарда нуклеотидов, три миллиарда долларов. Не все ожидания ученых оправдались (последовательность ДНК расшифрована, но не всегда понятно, что она кодирует), но технологическому прорыву в генетических исследованиях последнего десятилетия мы во многом обязаны именно работе над геномом человека. Вслед за ним стали активно секвенировать геномы других млекопитающих: 2002 — геном мыши, 2004 — крысы, 2005 — шимпанзе, 2007 — макаки [10] и так далее (в настоящий момент известны последовательности геномов почти 30 млекопитающих, а дальше это число будет только расти). Кроме этого, расшифровка генома человека привела к появлению специализированных геномных проектов, цель которых — описать работу определенной группы генов, связанных с работой отдельных систем органов или развитием какого-либо заболевания.
Транскриптом — это совокупность всех молекул РНК, которые синтезируются в клетке, в каком-то органе или ткани. Интересно, что хотя транскриптом и является продуктом экспрессии нашего генома, ни один из них не обеспечивает полное описание другого. Это связано с тем, что, с одной стороны, в геноме немало так называемой «мусорной» ДНК, которая ничего не кодирует (по крайней мере, так кажется). С другой стороны, существуют процессы, которые изменяют РНК после транскрипции: например, процесс редактирования РНК, который, согласно недавним исследованиям [11], распространен очень широко и происходит на более чем 90% всех мРНК. Кроме того, нельзя забывать, что в составе транскриптома есть не только белок-кодирующие мРНК, но и другие виды РНК — начиная от тРНК и рРНК и до различных видов малых регуляторных РНК.
Последовательность генома является более-менее постоянной характеристикой организма (хотя есть и исключения — например, последовательности некоторых генов разительно отличаются друг от друга в ДНК лимфоцитов одного человека). Транскриптом же может являться постоянной характеристикой органа, ткани или отдельной популяции клеток, т.к. разные типы клеток выполняют разные функции и экспрессируют разные гены, причем он также может зависеть от условий окружающей среды и меняться во времени. Именно поэтому в последнее время ученые все больше занимаются исследованиями транскриптома клеток определенного типа (например, эмбриональных стволовых клеток) или отдельных органов (например, транскриптома мозга человека).
1.Анализ транскриптома одиночных клеток
Компанией QIAGEN разработаны наборы реагентов для амплификации суммарной РНК и мРНК одиночных клеток:
Полнотранскриптомный анализ одиночных клеток
Амплификация суммарной РНК и поли-А обогащенной мРНК
Оптимизировано для использования с новыми технологиями, включая NGS
Инновационное решение для исследований рака и стволовых клеток
Набор реагентов REPLI-g WTA Single Cell обеспечивает надежный анализ регуляции транскрипции на уровне одиночных клеток и позволяет равномерно амплифицировать все транскрипты из одиночных клеток (1-1000 клеток). Входящие в состав буферы и реагенты подвергаются уникальной, контролируемой процедуре деконтаминации методом Repli-g для блокировки контаминации чужеродными нуклеиновыми кислотами. Инновационный компонент, буфер для лизиса, эффективно стабилизирует клеточную РНК, обеспечивая точное отображение профиля экспрессии генов полученного образца РНК. Все этапы ферментативной обработки разработаны специально для обеспечения эффективной обработки РНК и точной амплификации кДНК, которая достигается благодаря ничтожно малому изменению последовательности при использовании инновационной технологии – амплификации с множественным вытеснением цепи (Multiple Displacement Amplification, MDA).
Доступны следующие варианты наборов:
REPLI-g WTA Single Cell Kit (24), кат. номер 150063
REPLI-g WTA Single Cell Kit (96), кат. номер 150065
Характеристики наборов REPLI-g WTA Single Cell
Полное покрытие транскриптома с низкой вариабельностью результатов эксперимента
Набор REPLI-g WTA Single Cell содержит новую ДНК полимеразу SensiPhi, а также оптимизированный набор буферов и реагентов для полнотранскриптомной амплификации РНК из единичных клеток, 1000 клеток, либо эквивалентных образцов. Вслед за эффективным лизисом, полным удалением геномной ДНК и высокочувствительной обратной транскрипцией, с помощью набора проводится амплификация с множественным вытеснением цепи (MDA). Такой подход позволяет обеспечить однородную амплификацию кДНК всего транскриптома с незначительным уровнем ошибок копирования последовательностей. Амплифицированная таким образом кДНК демонстрирует высокую воспроизводимость от клетки к клетке и от эксперимента к эксперименту, при анализе специфических транскриптов как методом NGS, так методом ПЦР в реальном времени. Амплифицированная кДНК может быть легко использована для различных типов исследований.
Большое количество прочтений картируется на белок-кодирующие РНК
Возможность амплифицировать фракцию РНК, обогащенную мРНК (poly A+) делает набор REPLI-g WTA Single Cell особенно удобным для использования в NGS при исследовании регуляции транскрипции на уровне транскриптома одиночных клеток. Амплификация рибосомальной РНК (рРНК), которая составляет более 90% прочтений при NGS, практически исключена, что позволяет получать значимые данные секвенирования о мРНК. После полнотранскриптомной амплификации с использованием протокола обогащения мРНК, доля прочтений белок-кодирующих РНК превышает 80%.
Надежное обнаружение низкокопийных транскриптов
Анализ одиночных клеток может быть осложнен, когда копийность транскриптов сильно варьирует внутри клетки. Для получения достоверных результатов необходимо, чтобы точно амплифицировались все транскрипты, независимо от их копийности. Набор REPLI-g WTA Single Cell подходит для анализа даже низкокопийных транскриптов. Анализ методом ПЦР в режиме реального времени транскрипта abl-1, амплифицированного REPLI-g, показывает, что даже низкокопийные транскрипты могут быть успешно обнаружены, при использовании данного набора. В отличие от решений других производителей, набор REPLI-g WTA Single Cell WTA позволяет с высокой чувствительностью обнаруживать все транскрипты: как высоко-, так и низкокопийные.
Использование для широкого спектра исследований
С помощью набора REPLI-g WTA Single Cell Kit можно эффективно синтезировать и амплифицировать кДНК из одиночных клеток, таких как опухолевые клетки, стволовые или отсортированные клетки, а также из очищенной суммарной или поли А+ РНК (10 нг – 100 нг), что делает данный набор применимым для широкого набора исследовательских задач:
исследование биомаркеров (экспрессия);
исследование стволовых клеток;
анализ циркулирующих фетальных клеток;
изучение мозаицизма;
изучение генетической предрасположенности;
типирование трансгенных животных;
анализ соматических вариаций генома;
изучение прогрессирования опухолевого процесса;
анализ циркулирующих опухолевых клеток.
Принцип работы
На регуляцию транскрипции влияют различные факторы, такие как стресс, клеточное окружение, заболевания или соматических геномные отклонения (например, точечные мутации, вариации числа копий генов (CNV) или структурные изменения). Кроме того, посттранскрипционный процессинг, как, например, альтернативный сплайсинг, приводит к дифференциальному профилю экспрессии и, в конечном счете, к различным физиологическим процессам. Из-за сложной структуры тканей интерес к изучению регуляции транскрипции в одиночных клетках растет в большей степени, чем к анализу большего числа клеток и интерпретации результатов их усредненного поведения.
Набор реагентов REPLI-g WTA Single Cell Kit был специально разработан для надежного изучения регуляции транскрипции на уровне одиночных клеток
. Он представляет высоко унифицированную систему амплификации всего транскриптома с пренебрежимо малой ошибкой копирования генетической информации. Полнотранскриптомная амплификация одиночных клеток, проводимая с помощью REPLI-g WTA Single Cell Kit, сочетается с соответствующим набором для полногеномной амплификации (REPLI-g Single Cell Kit). Метод основан на технологии MDA, в которой применяется изотермическая амплификация кДНК с использованием уникальной высоко-процессивной ДНК-полимеразы, способной реплицировать до 70 тыс. п.о. без диссоциации с кДНК-матрицей.
Уникальные компоненты набора REPLI-g WTA Single Cell Kit:
Все ферменты и реагенты набора подвергаются уникальной контролируемой процедуре деконтаминации, чтобы элиминировать посторонние ДНК и РНК. После этого, наборы проходят строгий контроль качества и проверку всего функционала.
Инновационный лизирующий буфер эффективно стабилизирует клеточную РНК. Это обеспечивает высокую сходимость полученной РНК и профиля генной экспрессии in vivo.
Все стадии ферментативной обработки были специально разработаны для обеспечения эффективной обработки РНК для повышенной точности амплификации. Например, эти процессы включают количественное удаление геномной ДНК сразу после синтеза кДНК.
Новейшая ДНК-полимераза SensiPhi используется для амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA). Это недавно разработанный высокоаффинный фермент, который связывает кДНК более эффективно, особенно когда концентрация кДНК в реакционной смеси невысока. Более того, в отличие от методов, основанных на ПЦР, ДНК-полимераза SensiPhi обладает сильной корректирующей активностью, что приводит к 1000-кратному уменьшению ошибок. Фермент также имеет высокую активность по вытеснению цепи, позволяя реплицировать даже стабильные шпилечные структуры кДНК, которые устойчивы к полногеномным или полнотранскриптомным процедурам амплификации с использованием Taq-полимеразы.
Ход работы
Генетический анализ часто требует больших количеств кДНК. Полнотранскриптомная амплификация преодолевает ограничения, связанные с низким количеством РНК, позволяя анализировать малое количество клеток либо одиночные клетки. Простые и отлаженные этапы постановки и проведения реакции, малое время ручных процедур (20 минут) и общее время реакции для полной амплификации суммарной РНК, равное 4 часам, делают работу с набором REPLI-g WTA Single Cell Kit простым и надежным методом.
Набор REPLI-g WTA Single Cell Kit содержит компоненты для проведения ряда последовательных реакций:
Лизис клеток: образец одиночных клеток (1-1000 клеток) эффективно лизируется в течение 5 минут без потери целостности РНК. Лизированный образец используется для полностранскриптомного анализа суммарной РНК или, как вариант, фракции мРНК-обогащенной РНК (poly A+).
Синтез кДНК: далее, перед амплификацией, геномная ДНК удаляется, так как точность измерений уровня транскриптов зависит от отсева ложноположительных результатов, вызванных контаминацией геномной ДНК. В зависимости от выбранных праймеров для реакции обратной транскрипции, будут амплифицированы либо все транскрипты (при обогащении суммарной РНК с помощью random-праймера и олиго-dT), либо только полиаденилированные транскрипты (при обогащении на мРНК (poly A+) с помощью олиго-dT-нуклеотидов. Соответственно, реакционная смесь будет содержать либо олиго-dT- и random-праймеры, либо только олиго-dT, что уменьшит амплификацию рРНК и обеспечит обратную транскрипцию 3’-конца кДНК (размер транскриптов приблизительно 700-1000 п.н.).
Лигирование: синтезированная кДНК подвергается лигированию с применением высокоэффективной смеси для лигирования. Из-за характера реакции лигирования, фрагменты кДНК не собираются в том же порядке, в котором они были в клетке первоначально. Тем не менее, это не влияет на обнаружение последовательностей нуклеиновых кислот, например, областей сплайсинга, в последующих приложениях, таких как NGS или количественный ПЦР.
Полнотранскриптомная амплификация: лигированная кДНК амплифицируется в изотермической реакции по технологии MDA с помощью новой ДНК-полимеразы SensiPhi в течение 2х часов.
В зависимости от исследовательской задачи, разработаны различные протоколы для амплификации кДНК из одиночных клеток или очищенной РНК:
В протоколе «Амплификация 3'-областей мРНК (поли-А+) из одиночных клеток» происходит амплификация только мРНК (и других РНК) с поли-А-последовательностями, что подходит для широкого спектра приложений, включая NGS (РНК-Seq), ПЦР в реальном времени, и биочипового анализ.
В протоколе «Амплификация суммарной РНК из одиночных клеток» происходит амплификация всего транскриптома, включая РНК как с поли-A-последовательносттю, так и без нее, а также длинных некодирующих РНК. Следует обратить внимание, что рРНК также вступает в реакцию и будет присутствовать в повышенном количестве после амплификации. При работе с сиквенс-специфическими пробами, такими как количественная ПЦР или биочипы, амплифицированная рРНК не повлияет на результаты последующих приложений. При использовании амплифицированной РНК для РНК-Seq, нужно иметь в виду, что более 90% прочтений будут получены для рРНК.
Протокол «Амплификация очищенной РНК» оптимизирован для полнотранскриптомной амплификации суммарной или обогащенной РНК-матрицы и подходят для широкого спектра приложений, включая NGS, ПЦР в реальном времени и биочиповый анализ.
2. Анализ генома одиночных клеток
Компанией QIAGEN разработаны наборы реагентов для унифицированной полногеномной амплификации (WGA) из одиночных клеток или образцов с ограниченным количеством материала:
Полногеномная амплификация ДНК одиночных клеток с полным покрытием генома
Низкий уровень ошибок при амплификации геномных локусов благодаря технологии амплификации с множественным вытеснением цепи (Multiple Displacement Amplification, MDA)
Оптимизировано для использования с новыми технологиями, включая NGS
Стабильный выход до 40 мкг (средняя длина продукта >10 тыс. п.о.)
Новейший инструмент для исследований в области онкологии, изучения стволовых клеток и метагеномики
Анализ последовательности ДНК и генотипирование биологических образцов с использованием инновационных подходов, таких как секвенирование следующего поколения (NGS), часто ограничены малым количеством доступного для анализа материала. Набор REPLI-g Single Cell Kit специально разработан для унификации процедуры амплификации геномной ДНК из одиночных клеток (от 1 до 1000 бактериальных или опухолевых клеток) или очищенной геномной ДНК с полным покрытием. Дополнительные протоколы позволяют использовать образцы свежесобранной или высушенной крови, свежей или замороженной ткани. Предлагаемые буферы и реагенты проходят уникальную, управляемую процедуру деконтаминации для предотвращения амплификации посторонней ДНК, обеспечивая высокую надежность получаемых результатов. Точная амплификация геномов с пренебрежимо малыми ошибками при копировании последовательности и без каких-либо геномных делеций достигается с помощью инновационной технологии амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA). В сравнении с WGA (whole genome amplification) на основе ПЦР, точность репликации увеличена 1000-кратно, что позволяет избежать ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Доступны следующие варианты наборов:
REPLI-g Single Cell Kit (24), кат. номер 150343
REPLI-g Single Cell Kit (96), кат
Закажи написание реферата по выбранной теме всего за пару кликов. Персональная работа в кратчайшее время!
Нужна помощь по теме или написание схожей работы? Свяжись напрямую с автором и обсуди заказ.
В файле вы найдете полный фрагмент работы доступный на сайте, а также
промокод referat200
на новый заказ в Автор24.
