Вирус гриппа лошадей и вирус оспы обезьян

Введение

Грипп лошадей – остро протекающая высоко контагиозная болезнь лошадей, характеризующаяся кратковременной лихорадкой, угнетением, конъюнктивитом, слезотечением, катаром ВДП, сухим глубоким и болезненным кашлем. Болезнь часто сопровождается ларинготрахеитом, бронхитом, пневмонией. При сопутствующей пневмонии летальность животных достигает 5% [2].
Эпизоотии гриппа лошадей описаны задолго до выделения вирусов. В настоящее время они регистрируются во всех странах Европы, в США, Канаде и других странах. На территории РФ вспышка гриппа среди лошадей была зафиксирована в 2012 г. в Красноярском крае, где заболело 7 голов [4].
Наиболее тяжело заболевание протекает у жеребят. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Основными факторами передачи являются плохо продезинфицированные вагоны, боксы для лошадей, одежда и обувь персонала, инвентарь, сбруя, корма. Иногда одновременно с заболеванием лошадей гриппом наблюдают гриппоподобные заболевания среди обслуживающего персонала. Известны случаи, когда лошади заражались вирусом, циркулирующим среди людей [2].
Грипп лошадей может быть вызван большим числом типов и подтипов вируса, которые высокопатогенны для человека [4].
Исходя из актуальности темы, целью работы стало рассмотрение молекулярного строения и свойств вируса гриппа лошадей, а также изучение методов диагностики этого заболевания.


Характеристика вируса гриппа лошадей

Вирус гриппа А лошадей относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzavirus. Вирионы крупные, содержат фрагментированную РНК, покрытую липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой находятся выступы. Под электронным микроскопом имеют вид округлых или филаментозных (нитевидных) частиц (рис. 1). Диаметр сферических частиц составляет 80-120 нм. В их состав входят белки 60-70%, липиды (18-37%) и полисахариды (5-7%) [6].
Геном состоит из восьми неодинаковых по размеру фрагментов односпиральной минус-РНК. Вирус содержит 8 фрагментов. Каждый из фрагментов содержит одинаковую последовательность из 13 нуклеотидов. В вирионах обнаружено семь белков, из них четыре связаны с нуклеокапсидом, три (НА, NA, S) входят в состав липопротеиновой оболочки. Гемагглютинин и нейраминидаза являются гликопротеинами [7].
352044013779500
А)Б)
Рис. 1 Схематическое изображение (А) и электронная микрофотография (Б) вируса гриппа лошадей

Два поверхностных белка вириона вируса гриппа – гемагглютинин и нейраминидаза представляют V-антиген, а внутренний белок, входящий в рибонуклеопротеид РНП – растворимый S-антиген [5].
Гемагглютинин представляет собой мукопротеид. Молекула его представлена димером, состоящим из двух ковалентно связанных молекул гликопротеида, каждая из которых, в свою очередь, состоит из двух гликопептидов с М.м. 60 кД и 25 кД. Мономер гемагглютинина имеет палочковидную форму. В состоянии мономеров гемагглютинин не способен агглютинировать эритроциты, а может только сорбироваться на них [2].
Нейраминидаза или сиалидаза получила свое название благодаря способности расщеплять разные субстраты с выделением свободной N-ацетилнейроминовой кислоты. С этим ферментом связана элюция вируса гриппа с эритроцитов после адсорбции его на мукопротеидных рецепторах. Нейраминидаза составляет 7-15% от общего белка вируса.
S-антиген определяет серотип вируса гриппа [4].
Также имеются неструктурные белки – это вирусспецифические белки, образующиеся в клетке в процессе вирусной инфекции. Они принимают участие в репродукции вируса и входят в состав зрелого вириона. В составе последнего имеется РНК-зависимая РНК-полимераза, которая синтезирует минус-нити РНК, комплементарные плюс-нитям вирионной РНК. Различают две разновидности РНК-полимеразы: вирионную РНК-транскриптазу и РНК-репликазу. Первая ответственна за синтез минус-цепей в ранний период инфекции, вторая – за синтез плюс-цепей на более поздних этапах репликации вируса гриппа [5].
В клетку вирионы проникают путем эндоцитоза и сплавления оболочки вириона и мембраны клетки (рис. 2). Транскрипция осуществляется в ядрах клеток. Каждый фрагмент вирионной РНК транскрибируется независимо. Синтез вирусспецифических белков происходит в цитоплазме клетки. Гликопротеины мигрируют к наружной оболочке и встраиваются в неё. Созревание вирионов происходит почкованием нуклеокапсидов через модифицированные участки клеточной мембраны. Ключевая роль в процессе созревания принадлежит М-белку, который выстилает изнутри клеточную мембрану [1].

Рис. 2 Цикл репликации вируса гриппа лошадей

В состав вируса гриппа входят белки (антигены) пяти видов: белок нуклеоида, гемагглютинин, нейраминидаза, транскриптаза и белок внутренней мембраны. Два последних входят в состав базальной мембраны, на которой находится гемагглютинин. Белок нуклеоида составляет основу нуклеокапсида вирусной частицы. Внешняя оболочка состоит из двух слоев.
Антигенную структуру штаммов-изолятов вируса гриппа лошадей и их антигенное родство изучают в перекрестной реакции торможения гемагглютинации с антисыворотками иммунизированных крыс.
У больных лошадей накапливаются в высоких титрах комплементсвязывающие антитела к растворимому S-антигену и штаммоспецифическому V-антигену [6].
Антитела вируснейтрализующие и антигемагглютинины в сыворотках иммунизированных крыс появляются после двукратного введения антигена и обычно достигают максимума после 4-кратного введения. Штамм А/лошадь/1/Кембридж/63 более антигенно активен, чем штаммы А/лошадь/1/Прага/56 и А/лошадь/2/Майами/63.
До последнего времени считали, что существует два подтипа вируса гриппа лошадей, отличающихся по V-антигену: А/лошадь/1/Прага/56 и А/лошадь/2/Майами/63. Большое количество штаммов лошадь 2 было выделено от скаковых лошадей в районах Северной и Южной Америки, затем в Швейцарии, Франции, ФРГ, Италии. Высказано мнение о том, что вирус А/лошадь/2 ранее у лошадей не встречался. В последнюю вспышку гриппа лошадей на территории УССР выделенные полевые штаммы обнаружили с ним четко выраженное антигенное родство. Все нейраминидазы и гемагглютинины различных штаммов вируса гриппа лошадей подтипа А/лошадь/2 независимо от их происхождения антигенно идентичны. Выявлено незначительное антигенное различие лишь между штаммом А/лошадь/Прага/56 и штаммами того же подтипа, но выделенными в 1973 г. Однако в последние годы было показано, что у лошадей грипп может быть вызван большим числом типов и подтипов

. В 1971-1972 гг. при вспышке гриппа лошадей в Японии выделенные изоляты вируса Чиба-2 и Чиба-3 несколько отличались от референс-штамма А/лошадь/2/Майами. Видимо, в пределах этого типа вируса произошла антигенная мутация [7].
В 1974 г. в Финляндии вспыхнула эпизоотия гриппа среди лошадей, которая была вызвана новым антигенным вариантом вируса А/лошадь2/Хельсинки/74. Описана вспышка гриппа у лошадей, вызванная вирусом В/лошадь/Неаполь/67, который идентичен вирусу гриппа человека типа В-Ли и С/лошадь/Дитчфилд/1965. Грипп лошадей в Италии был связан со штаммами вируса гриппа человека А2/Сиигапур и В-Ли. Вирус В-Ли впервые был выделен от лошадей в 1973 г. Штаммами этого типа (№ 86 и № 89) удалось заразить лошадей и вызвать клиническую картину гриппа. Видимо, антигенная изменчивость вируса гриппа лошадей также проявляется в виде «антигенного дрейфа» [2].
Установлены небольшие различия в антигенном отношении между штаммами Майами-2/1/63 и японским штаммом Нигата-2/71. В сыворотках крови людей, больных гриппом типа Гонконг, обнаружены антитела к штаммам лошадь-2/Нигата/2/71.
Современные представления об антигенных связях между вирусами гриппа лошадей и человека основаны не только на серологических данных, но и на экспериментальных исследованиях. Полученные в условиях лаборатории рекомбинанты содержали гемагглютинин вирусов животных и нейраминидазу вирусов гриппа человека. Высказано предположение о том, что вирус А2/Гонконг/68 можно рассматривать как гибрид вирусов А/лошадь-2/Майами/63. В 1968 г. Мазурел показал, что вирус гриппа лошадей А/лошадь 2 представляет собой вариант гриппозного вируса человека, что подтверждено прямым опытом заражения людей этим вирусом. Показано, что вирусы гриппа человека А2/Сингапур/57 и А/лошадь 1/Прага/56 имеют идентичный гемагглютинирующий компонент – агглютинируют эритроциты телят, лошадей и свиней, а данные по распределению антител к вирусу гриппа лошадей А/лошадь 2 в сыворотках крови лиц старше 60 лет свидетельствуют о циркуляции в прошлом вируса, родственного гриппу лошадей в период пандемии 1889-1890 гг. Не без основания некоторые авторы считают, что вирус гриппа лошадей является резервуаром вируса гриппа человека. Согласно современной классификации, все выделенные штаммы вируса гриппа лошадей относятся к типу А, подтипам 1 и 2. Гемагглютинин и нейраминидаза типируются в зависимости от вида хозяина, от которого выделен вирус [4].
По способности агглютинировать эритроциты различных видов полевые штаммы вируса гриппа лошадей можно разделить на две группы, соответствующие двум антигенным подгруппам. Штаммы А/лошадь в отличие от штаммов вирусов гриппа человека, свиней и птиц типа А избирательно агглютинируют эритроциты лошадей, ослов и крупного рогатого скота [5].
Эталонные штаммы вируса гриппа лошадей А/лошадь/2/Майами/63 и А/лошадь 1/Кембридж/63 оказались резистентными к сывороточным ингибиторам крупного рогатого скота. Сыворотки лошади, кур, белых крыс, белых мышей не содержат ингибиторов к отечественным и эталонным штаммам вируса гриппа лошадей.
Гемагглютинирующая активность отечественных и эталонных штаммов вируса гриппа лошадей в условиях 37° сохранялась на достаточно высоком уровне в течение девяти суток (1:64). По стабильности гемагглютининов к прогреванию при температурах 56°, 60° и 65° эталонные и полевые штаммы можно разделить на две группы: первая группа, соответствующая штамму А/лошадь 2, сохраняла гемагглютинирующую активность при 60° С и утрачивала ее при 65° С за 10 мин. У штаммов второй группы – А/лошадь 1 и изолята 10 – гемагглютинирующая активность резко снижалась при прогревании в течение 15 мин в условиях 56° и полностью исчезала в течение часа [1].
Гемадсорбирующие свойства. Предложен ускоренный метод титрования ВГЛ по подсчёту гемадсорбирующих клеток. Этот метод при использовании высокочувствительной перевиваемой линии клеток МДСК (почки собак) и 0,4%-ной взвеси эритроцитов морской свинки обеспечивает получение результатов уже через 8 ч после заражения [6].
Впервые вирус гриппа лошадей культивировали в развивающихся куриных эмбрионах в 1958 г. Максимального титра вирус в зараженных эмбрионах достигает к 72 ч. Он содержится в равных титрах в экстраэмбриональной жидкости и оболочках эмбриона. Зараженные эмбрионы обычно не погибают. Вирус, выделенный на куриных эмбрионах, легко адаптируется к клеткам почек обезьяны [2].


2. Диагностика гриппа лошадей

2.1 Выделение вируса

Материалом для исследования служат выделения слизистой оболочки носа (смывы) от больных животных или бронхиальный экссудат и кусочки лёгких от павших животных. Инфекционный материал в лаборатории исследуют как можно быстрее. Если в течение 6-8 ч сделать это невозможно, пробы следует заморозить до -60°С и хранить [4].

2.2 Индикация и идентификация вируса

Проводят методами, используемыми как и при гриппе других животных. Для идентификации полевых штаммов гриппа лошадей их вначале адаптируют к куриным эмбрионам (КЭ), определяют титр в гемагглютинации (ГА) и затем используют в РТГА. ИФ – надёжный метод ранней диагностики. Антиген обнаруживается в цитоплазме клеток.
Вирус чаще всего выделяют в КЭ 10-12-дневного возраста, которые заражают обычно одновременно в полость алантоиса и амниона, инкубируют в течение 2-4 дн при температуре 33-35°С [5].
Для исследования одной пробы материала заражают не менее 6 эмбрионов. Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, карандашом на скорлупе отмечают границу воздушного пространства (нуги). Сбоку яйца между кровеносными сосудами отмечают участок для прокола скорлупы и инокуляции испытуемого материала. Отобранные для заражения эмбрионы переносят в бокс. Скорлупу со стороны нуги и участок, где намечено производить прокол иВведение

материала, тщательно протирают спиртом и обжигают. В центре воздушного пространства и в месте введения материала сбоку, пробойником делают отверстия, затем через боковое отверстие на глубину 2—3 мм вводят испытуемый материал в объеме 0,2 мл [3].
После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином и переносят их в термостат, где инкубируют в течение 72 часов при температуре 37,5°. В процессе инкубации их овоскоируют один раз в сутки, погибшие эмбрионы до вскрытия сохраняют в холодильнике при +4°